揭示病毒基因组复制机制的惊人详细蓝图

RNA病毒，例如导致COVID-19的冠状病毒，在感染细胞的那一刻就处于生死竞赛中。

这些病毒只有几分钟的时间在宿主细胞内建立它们的复制机制，然后其脆弱的RNA基因组中包含的遗传指令 - 比DNA更脆弱 - 将被细胞内务管理破坏。如果成功，病毒可以在不到12小时的时间内从其RNA基因组的几个拷贝变成新感染性颗粒中的五十万个拷贝。否则，病毒就会死亡。

在1月24日由美国国家科学院院刊(PNAS)在线发表的研究中，Morgridge研究所的科学家们对病毒感染及其控制的这些关键早期阶段提出了新的见解。研究人员开发了从细胞中释放病毒RNA复制复合物的新方法，并通过冷冻电子显微镜(cryo-EM)以复杂的方式可视化它们。

冷冻电镜将高度先进的成像与广泛的计算分析相结合，使科学家能够以分子到原子分辨率可视化天然状态下的闪速冷冻分子，从而对生物结构提供革命性的见解，这为开发阻止疾病的疗法奠定了坚实的基础。

该研究小组由该研究所约翰和珍妮·罗病毒学中心主任、威斯康星大学麦迪逊分校分子病毒学和肿瘤学教授Paul Ahlquist领导。该团队包括科学家Hong Zhan，Nuruddin Unchwaniwala和Johan den Boon，Morgridge研究员和威斯康星大学麦迪逊分校生物化学助理教授Tim Grant，以及合著者Andrea Rebolledo-Viveros，Janice Pennington，Mark Horswill，Roma Broadberry和Jonathan Myers。

大多数微生物和宿主基因在作为分子机器运行的大型蛋白质复合物中起作用。然而，这些关键组件的结构在很大程度上是未知的，这极大地限制了对相关过程的理解和控制。2017年，Ahlquist实验室使用先进的模型病毒，首次对病毒RNA复制复合物及其引人注目的组织进行了全面成像。

他们发现亲本病毒基因组RNA“染色体”紧密地盘绕在保护膜囊泡内，他们发现其通往细胞质的颈部通道是实际病毒RNA复制机制的所在地 - 基因组复制的动态，多功能引擎 - 在一个以前未知的，12倍对称的环形复合体中，他们称之为“皇冠”。

现在，在PNAS的新论文中，该团队通过揭示这种分子冠及其组分酶域在原子到近原子分辨率下的复杂结构，提出了进一步的飞跃。这些分辨率明显更高的结果显示了这种复制引擎的许多不同功能模块是如何排列的，为制定其组装、动态操作以及干扰两者的方法提供了重要基础。

为了进行比较，第一作者Hong Zhan说：“我们实验室在2017年对皇冠机械的首次可视化就像识别建筑物的存在和总体轮廓一样。新的 2023 年分辨率就像展示了精细的细节，例如电线和门锁。

“在病毒学中，”Ahlquist说，“迄今为止人们关注的复合物主要是在细胞之间移动的感染性颗粒，这些颗粒相对容易纯化和研究，因为它们会从细胞中释放出来。

“然而，大多数病毒复制过程发生在细胞内的复杂环境中，”他补充道。“这是一个新的篇章，我们已经能够深入细胞内部，非常详细地捕捉和成像执行病毒复制中心事件的更复杂的病毒机制。

团队成员Johan den Boon指出，除其他结果外，他们发现“冠由一个巨大的病毒RNA复制蛋白的两个堆叠的12-mer环组成，其多个结构域提供了合成病毒基因组RNA新拷贝所需的所有功能。然而，上环和下环中的蛋白质具有显着不同的构象，它们的组成结构域相对于彼此处于不同的位置。

一个含义是，相同的蛋白质结构域在上环和下环中以不同的方式运作。其他多项功能强调，表冠不是一个静态的结构，而是一个精密、活跃的机器，它通过一系列运动进行和循环，以执行其连续的活动。基于这种结构和进一步的针对性实验，Morgridge团队正在阐明冠的功能和体操。

这些研究的另一个有价值的发现是，较低的12-mer环是在RNA复制的实际步骤之前形成的组装前体。然后，这种“原冠”前体招募病毒基因组RNA模板和其他组分以启动新RNA的合成，并作为组装成熟双环复制复合物的基础。

越来越多的证据表明，冠不仅合成了病毒RNA基因组的新拷贝，而且还有助于将这些新基因组递送到基因表达和新传染性病毒颗粒组装的下游过程中。因此，冠似乎为组织整个感染过程中的许多关键阶段提供了主要功能。

“仅仅减慢RNA复制复合物的组装和功能就足以杀死这些病毒，”Ahlquist说。“这些新结果为寻找新的方法提供了坚实的基础。

Ahlquist和其他团队成员称赞威斯康星大学麦迪逊冷冻电镜研究中心(CEMRC)及其领导对他们的进步至关重要。CEMRC正在使这项有价值的技术可供威斯康星大学麦迪逊校区的数十名科学家使用，并作为国家中心，远远超出。在生物化学教授Elizabeth Wright的带领下，CEMRC在几乎所有形式的冷冻电镜成像中提供了先进的功能。

来自Morgridge小组和其他研究人员的新结果表明，这些研究揭示的原理在进化上是古老的，并且类似的冠状复合物对于这一大类中大多数(如果不是全部)RNA病毒的复制至关重要。这包括COVID-19 SARS-CoV-2冠状病毒和许多其他病原体。

因此，保守的基本原则可以作为开发更强大，广谱抗病毒策略的基础，这些策略不仅可以抑制一组病毒的感染，还可以抑制整组病毒的感染，Ahlquist说。